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技术交流

首页 - 技术交流 - 牛血清常见问题

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血清的含义

血清,在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。


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牛血清的主要成份

血清是一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知,但还有一部分尚不清楚,而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。

 

1. 蛋白质是牛血清中主要成份之一。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白,球蛋白,纤维粘连素(细胞促进细胞附着),α2巨球蛋白(抑制胰蛋白酶的作用);胎牛血清中含胎球蛋白(促细胞附着),转铁蛋白(能结合铁离子,减少其毒性和被细胞利用)。

 

2. 多肽:血小板促生长因子能促细胞分裂,是多肽家庭的主要成员之一,是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等,血清中含量虽很少,但对细胞生长也有一定作用。

 

3. 激素:激素对细胞的作用是多方面的。

胰岛素:促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,与促细胞分裂有关。

类胰岛素生长因子:能与细胞表达的胰岛素受体结合,从而有胰岛素同样的作用。

促生长激素:促细胞增殖效应。

氢化可的松:血清中含有定量的该成分,它可能兼有促细胞贴附和增殖作用,但有人证明,血清中的氢化可的松,如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

 

4. 其他成份

氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。


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牛血清的主要作用

1. 提供维持细胞指数生长必须的蛋白质、核酸、微量元素和多肽;

2. 维持细胞的胶体渗透压;

3. 结合蛋白能与有毒金属或热原质结合,起到解毒作用;

4. 促进细胞在培养瓶上贴壁生长与扩增;

5. 平衡细胞培养液PH值的作用;

6. 抑制蛋白酶活性,从而保护细胞免受伤害。


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牛血清的用途

血清是一种纯天然培养基,富含细胞生长繁殖的多种营养成分,诸如蛋白质、核酸和多肽等。并能保护细胞,使其免受损害。主要用于细胞培养、生物制品及诊断试剂的生产。


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优质牛血清的要求

应是纯天然的、未加抗菌素和防腐剂:无菌、无支原体、无牛病毒、无噬菌体、低内毒素及良好的促细胞生长效应。


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生产优质牛血清的方法

1. 牛血清的来源:健康的不受感染的牛群及新生牛出生后及时采血,这是制备优质新牛血清的首要保证。

 

2. 采血要求:采血技术人员须经专业培训:采血所需的工艺、设备能保障牛血不受外源性污染;严格无菌的采血操作规范;洁净的采血环境,这是使采集的血液不受污染的必要保证。

 

3. 加工工艺与设备:符合GMP要求的洁净车间;精密的过滤系统;独特的制备工艺;严格的血清加工操作规范,这是生产优质牛血清的关键所在。

 

4. 质量检验:高等专业技术人员;先进的检验设备;完善的检验指标与检测方法,这是确保优质牛血清质量的重要保证。

 

5. 产品监制:中国食品药品鉴定研究院对本公司牛血清产品进行监制;定期按生产批数的一定比例进行抽检,这是牛血清质量的最终保障。


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胎牛血清、新生牛血清、小牛血清有何区别

胎牛血清:指健康母牛正常分娩前采集胎牛血液加工而成的血清,其胎球蛋白较多,血清白蛋白含量高,而r-球蛋白含量极低甚至没有,并富含多种生长因子,是培养细胞最优质的血清。

新生牛血清:指健康母牛正常分娩后不久采集加工而成的血清,其内含多种生长因子。

小牛血清:指出生后饲养一定时间(一周至六个月)再采集加工而成的血清,因与外界接触时间过长,故血清内r-球蛋白含量较高,不利于细胞培养,特别是不利于病毒研究与疫苗生产。


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为何牛血清中会污染噬菌体,其危害表现在什么地方

噬菌体是感染细菌的病毒,牛血清中污染噬菌体,表明该牛血清曾受到细菌污染,而受细菌污染过的牛血清,不仅对固有的营养成分有所损害,更重要的是牛血清中会因细菌污染而含有许多毒素,对细胞生长不利。牛血清是否污染噬菌体是检测牛血清在整个加工过程中有否受到外源性污染的一个重要指标。


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牛血清中污染支原体对细胞培养的危害

牛血清是细胞培养中最重要的原辅材料,牛血清若污染支原体会使培养的细胞受感染。导致细胞病变而死亡,使科研和生产工作无法继续进行。


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牛血清中污染病毒对细胞培养的危害

牛血清中污染了病毒,若所培养的细胞对此病毒敏感,会使细胞发生病变、死亡,使后续工作无法进行。


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★选择适合自己细胞培养的牛血清的最简单方法

由于牛血清的批间差异和细胞种类不同,因此要找到一批适合自己用的牛血清的最简单有效的方法是——用户在购买牛血清前先试用样品,通过筛选得到自己满意的牛血清批号,然后把整个项目所需的牛血清一次买足,保持整个项目所需牛血清质量的一致性,这样能够确保项目如期顺利完成。


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★如何保存牛血清

血清应保存在-10℃~-30℃。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装后再放回冷冻。


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★如何解冻血清才不会使其质量受损

我们建议您将血清从冷冻箱中取出后,先置于4℃冰箱中解冻或部分融化,然后再根据药典范例“常温”10~30℃下使之全部融化。

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★牛血清中蛋白质的析出,如何处理

牛血清经过冻融或灭活后有时会有少量纤维蛋白的析出,这是理化因素致血清中脂蛋白变性和纤粘连蛋白凝聚而形成沉淀。但这些絮状沉淀物并不影响血清的质量。欲去除这些物质,可以将血清分装至无菌离心管内,以1000转/分~2000转/分离心,这样可以有效的去除沉淀物。


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★何谓热灭活?有无必要

一般以56℃,30分钟来处理已解冻的血清,该过程确保受热均匀,因为此加热步骤,可以使补体去活性,而补体所参与的反应有:溶细胞活性,平滑肌的收缩,肥大细胞和血小板组胺的释放,增强吞噬作用,淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经过处理的血清对细胞生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您,若非必须,您可以不需要做热灭活这一步。如此以来,不但节省您宝贵的时间,更确保您血清的质量!


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如何避免沉淀物的产生

我们建议您在使用血清的时候,注意正确的解冻步骤,在灭活血清时,严格遵守对操作时间和温度的要求。


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如何选用细胞培养基

在实验工作中,选用适当的培养基,有利于工作的顺利进行。首先要了解所要培养的细胞的特性,如细胞类型;细胞生长特点,是贴壁生长还是悬浮生长,以及其传代时间等。其次,要注意培养基的血清浓度。选用的培养基建议与细胞采购信息一致,常用培养基有DMEM、MEM、1640等。


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★何时更换培养基/血清

1.视细胞生长密度而定,或遵照细胞建株的时间要求,按时更换培养基即可。另外,由于每一细胞株均有与其相适应的细胞培养基,不能骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基。这会影响细胞生长,实在无法供应的应半量替换,使细胞有一适应期。

2.更换不同批次血清前应做细胞适应性实验,不能立即完全更换血清批号,防止细胞因不适应新批次血清而死亡,降低损失。

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能否使用与原来培养条件不同类别的血清

 不能使用与原来培养条件不同类别的血清

血清是培养细胞的一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,其含有的细胞生长必须的营养成分不同,所以血清使用错误常会造成细胞无法存活。


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培养细胞时应使用5%CO2还是10%CO2

一般培养基大都使用HCO3-/ CO3-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中 NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7克时,细胞培养时应使用10%CO2;当培养基中 NaHCO3含量为每公升1.5克时,则应使用5%CO2培养细胞。


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Hank’s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培箱,其原因是什么?Hank’s平衡盐溶液(HBS)和Eagle’s平衡盐溶(EBS)在功能上有什么本质区别

HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平上,在Eagle’s(2.2g/L)中比在 Hank’s(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高浓度的CO2平衡,以维持溶液的pH值。Eagles液在空气水平的CO2中,溶液会变 碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用 Hanks液就可以了。


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接种细胞密度以多少为宜

按照细胞株接种密度的基本数据或将细胞按比例稀释成一定密度梯度后分瓶进行接种即可,一般以1ⅹ105个/ml为宜。细胞数太少或过度稀释都不利于细胞生存和繁殖。这亦是造成细胞无法生长的主要原因之一。


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冷冻管应如何解冻

取出冷冻管后,必须立即放入37℃水浴中快速解冻,轻摇冷冻管使其在一分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。此外,冷冻管由液氮罐中取出解冻时,必须注意安全,以预防冷冻管爆裂。


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细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO

除少数特别注明对DMSO敏感的细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,直接放入含有10%血清的新鲜培养基的瓶中即可。待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO,避免离心后损伤细胞。


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贴壁细胞传代时所用胰酶的浓度为多少

一般使用的胰酶浓度为0.25%胰酶-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成胰酶之活性降低,并可减少污染之机会。


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细胞冷冻培养基的组成

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 % 原来细胞生长用之新鲜培养基式纯血清均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。


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冻存用DMSO有何要求

冷冻保存使用之DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。


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冷冻保存细胞之方法

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30分钟) → -60℃~-80℃ 16~18 小时(或隔夜) → 液氮中储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃以下, 再放入液氮中储存。-20℃ 不超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-60℃~-80℃ 冰箱中,但存活率稍微降低一些。


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细胞冷冻保存时,细胞浓度应多少为宜

冷冻管内细胞数目一般为1~5x106cells/ml vial 为宜。


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培养基中是否须加抗生素

除特殊筛选外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。


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应如何避免细胞污染

细胞污染的种类可分成细菌、真菌、病毒等。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、使用污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。


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如果细胞发生污染时,应如何处理

原则上:直接灭菌后将其丢弃。

当重要的细胞株被污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或其他,把污染细胞与其他细胞隔离开,用实验室消毒剂消毒培养皿和超净台,检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞株有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤为重要。

此外,也可将污染的细胞株注射到纯系小鼠的腹腔,10天后回收细胞镜鉴是否已消除污染。


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★为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中,颜色会变,且pH值会越来越偏碱性

培养基保存于4℃冰箱中时,其内的CO2及其他物质 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中酸碱指示剂(通常为酚红) 的颜色也会随碱性增加而变化。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。 建议控制培养液配置用量,不要长期存放,若培养基偏碱性时最好重新配制。


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引进的细胞存活率不佳可能因素

在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:于建株时培养条件不同(包括培养基和血清);细胞冻存、复苏操作不规范;细胞建株已久,体外传代过频。建议细胞株适当扩增后应冻存保株,以免丢失。


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★在细胞培养过程中疑有运动的“小黑点”

在细胞培养过程中发现小黑点,习惯叫“黑胶虫”,400倍显微镜下观察到黑点呈半透明,分布在细胞间隙,上下翻滚运动,在细胞培养过程中有增多趋势,但培养液不浑浊。若有此现象,建议进一步作无菌培养,批出外浮游生物污染,清洁净化工作环境,规范无菌操作,消除污染源。


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★细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成,首先,要肉眼观察培养基是否混浊,然后,在镜下观察培养细胞生长的状态,黑点是否游动。如果细胞被污染,微生物则会大量繁殖,培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。

如果在镜下观察细胞,生长状态良好,与黑点出现前相比,没有任何变化,那么,黑点的出现可能与以下几种情况有关:

1.细胞生长过老,破碎的细胞残骸;

2.血清析出物,可能与保存化冻有关;

3.配制培养基的pH值偏高,不宜细胞生长;

4.配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;

5.培养原代细胞中出现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。


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细胞培养中如何防止黑点生成

1. 尽可能地减少血清冻融次数。 

2. 培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。 

3. 严格控制配制培养基的水质,容器按要求清洁后是否确认清洁有效及去污剂残留。 

4. 掌握细胞传代的最佳时机,细胞切勿生长过老。


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